海洋細菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在海洋物質(zhì)循環(huán)、能量流動以及生態(tài)調(diào)控等方面具有重要作用.海洋細菌的群落結(jié)構(gòu)與種類組成直接影響整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展，同時細菌群落結(jié)構(gòu)又與其棲息的環(huán)境密切相關(guān).海洋細菌的分類鑒定及其群落結(jié)構(gòu)的分析方法包括表型鑒定法和分子遺傳學鑒定法兩大類(金光，2011)，表型鑒定法包括細菌形態(tài)和生理生化水平、細胞組分水平、蛋白質(zhì)水平上的鑒定，分子遺傳學鑒定法是在核酸水平上的鑒定，包括核酸雜交、PCR 技術(shù)、16S rRNA序列分析、全基因組測序等.
變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)最早是由Fischer和Lerman于1983年創(chuàng)立的，是根據(jù)在不同濃度的變性劑中DNA片段解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的片段分開.近年來PCR-DGGE技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于細菌的群落結(jié)構(gòu)分析中.
大亞灣位于南海北部，是廣東省重要的養(yǎng)殖基地，也是大亞灣核電站和惠州港所在地.由于近些年該海域污染日趨嚴重，海洋環(huán)境狀況發(fā)生顯著變化，浮游細菌群落結(jié)構(gòu)也會發(fā)生明顯變化.目前有關(guān)大亞灣浮游細菌方面的報道不多，尚未有浮游細菌DNA指紋及分子多樣性方面的報道.為了了解大亞灣海域浮游細菌群落結(jié)構(gòu)以及分子多樣性，本文采集了大亞灣海域表層水樣，利用PCR-DGGE技術(shù)對浮游細菌的DNA指紋進行了研究，以揭示DGGE技術(shù)等分子手段在浮游細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析上的應用.
2 材料與方法
2.1 樣品的采集與處理
在廣東省大亞灣海域設(shè)置的9個采樣點(圖 1).S1～S3位于大亞灣澳頭海域，該海域毗鄰惠州市澳頭鎮(zhèn)，是重要網(wǎng)箱魚類養(yǎng)殖基地;S4～S6位于大鵬澳海域，該海域位于深圳市大鵬鎮(zhèn)，灣內(nèi)有魚類和貝類養(yǎng)殖區(qū)，同時也是大亞灣核電站和嶺澳核電站所在地;S7～S8位于大亞灣灣口，受到養(yǎng)殖和人類活動的影響較小.分別于2010年12月15日(2010年冬)、2011年6月8日(2011年夏)采集表層水樣，每個采樣點采集水樣9 L，并在現(xiàn)場用中性魯哥試劑固定.固定的水樣先用孔徑為10 μm網(wǎng)篩過濾，然后再依次用GF/A濾膜(Whatman)以及 0.2 μm 聚醚砜濾膜(Millipore)過濾，濾膜上的樣品置于1.8 mL SET裂解緩沖液(20% 蔗糖，50 mmol · L-1 Tris-HCl pH 7.6，50 mmol · L-1 EDTA)中，儲存在-20 ℃待分析.
圖1 大亞灣采樣點的設(shè)置
2.2 水環(huán)境因子的測定
水溫、鹽度、電導率、溶解氧(DO)、pH值等理化因子通過采用美國YSI-561多參數(shù)水質(zhì)分析儀進行現(xiàn)場測定，透明度用薩氏盤測定.
2.3 DNA的提取及16S rRNA基因V3區(qū)的PCR擴增
利用美國Omega公司細菌基因組DNA的提取試劑盒提取細菌基因組DNA，方法參照產(chǎn)品說明書.采用原核生物通用引物Eubac341F(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和Eubac517R(5′- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)對細菌rRNA基因16S V3區(qū)的保守序列進行PCR擴增(Muyzer et al., 1993; Celussi et al., 2008)，并在Eubac341F 5′端添加GC2夾子:5′- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC-3′)，擴增體系為30 μL，擴增體系中各組分含量為別為：10×buffer 3 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 21 μL.PCR擴增反應程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，65~55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s每個循環(huán)降0.5 ℃，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s)× 20個循環(huán)，72 ℃ 7min，4 ℃ ∞.擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，用1×的gelgreen工作液進行膠前染色.
2.4 DGGE分析
取PCR產(chǎn)物30 μL，在Bio-Rad公司的DcodeTM通用突變檢測系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行DGGE分析，DGGE條件為：丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù) 8%，變性梯度40%～64%(100%的變性劑濃度為7 mol · L-1尿素和質(zhì)量分數(shù)40%去離子甲酰胺)，并在上述兩種凝膠液中分別加入100 μL 10%的過硫酸銨(ASP)和10 μL的四甲基乙二胺(TEMED).先用200 V預電泳20 min左右以去除膠空中的雜質(zhì)，然后加入PCR產(chǎn)物樣品，200 V電泳5 h.200 V電壓電泳20 min，然后再用 200 V電壓電泳5 h，緩沖液為1 × TAE，電泳結(jié)束后用超純水沖洗兩次，后置于1×SybrGreen工作液中避光染色30 min，用 Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc2000TM)進行拍照，DNA指紋圖譜用Quantity one軟件進行分析.
2.5 數(shù)據(jù)分析與處理
2.5.1 Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)
式中，n為每個泳道的條帶數(shù)目，Pi=Ni/N，Ni為第i條條帶的峰面積，N為該泳道所有條帶的峰面積總和.
2.5.2 Pielou均勻度指數(shù)(J)
其中，H′為某泳道的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)，S為對應泳道的DNA指紋條帶數(shù).
2.5.3 統(tǒng)計分析
利用SPSS 18.0對冬季和夏季浮游細菌DNA指紋條帶數(shù)、H′和J值進行顯著性差異t檢驗，對DNA指紋條帶數(shù)與環(huán)境因子進行Pearson相關(guān)性分析.
3 結(jié)果
3.1 水環(huán)境因子
表 1列出了兩次調(diào)查中大亞灣海域各站位的水環(huán)境因子，可以看出大亞灣海域水溫較高，即使在12月份的冬季，水溫仍可以達到20 ℃左右;夏季水溫則高達29 ℃左右.各站位間水溫差異不大，一般小于1 ℃.兩次調(diào)查期間鹽度相近，在33~34之間.冬季pH值略高于夏季，而DO值和透明度則明顯高于夏季.
表1 2010年冬及2011年夏大亞灣海域水環(huán)境因子
3.2 DGGE指紋圖譜分析
2010年冬季和2011年夏季大亞灣海域浮游細菌的DNA指紋圖譜見圖 2.結(jié)果顯示，條帶分離較好，冬季條帶亮度較夏季弱，冬季浮游細菌豐度較低.從帶型模擬圖(圖 3)中可以更清楚看到各站位浮游細菌DNA指紋圖譜，冬季和夏季樣品中分別共得到32條和33條條帶.
圖2 大亞灣海域浮游細菌16S rDNA V3區(qū)DNA圖譜(a. 2010年冬，b. 2011年夏)
圖3 大亞灣海域浮游細菌16S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜分析帶型圖(其中水平軸上的數(shù)字(1～9)為站點編號，百分比是與標準泳道的匹配度; 垂直軸上的數(shù)字為DNA條帶編號(a. 2010年冬，b. 2011年夏))
冬季樣品共有的優(yōu)勢條帶較多，如灰度較大的優(yōu)勢菌群條帶1、2、5、8、10、11、12在各個站位均有出現(xiàn)，條帶1和條帶2為最為常見優(yōu)勢條帶，條帶11和12在S2以及S5~S8站位較為豐富(圖 3a).以S7為標準，其余站位與之匹配度為49.8%~76.7%之間，位于大鵬澳海域的幾個站位與S7的匹配度較高，而位于澳頭海域的S1~S3與之匹配度較低，說明這兩個海域浮游細菌存在一定空間異質(zhì)性，但整體來說比較均一.
夏季樣品中共同的優(yōu)勢條帶較少(圖 3b)，條帶2在每個站點均出現(xiàn)，且灰度值比較大，為優(yōu)勢菌群;但有些灰度值較大的條帶(優(yōu)勢菌群)只在部分采樣點出現(xiàn)，如條帶3、10、21、31.以S3為標準，所有泳道與S3的匹配度差別不大，在60.0%~68.6%之間(圖 3b)，說明夏季浮游細菌空間分布差異較低.
3.3 浮游細菌DNA指紋多樣性
大亞灣海域浮游細菌DNA指紋條帶數(shù)見圖 4.各站位條帶數(shù)變化不大，冬季為18~22條，平均為20條;夏季較高，為19~25條，平均為23條.夏季指紋條帶數(shù)明顯高于冬季(p<0.01).
圖4 大亞灣浮游細菌DNA指紋條帶數(shù)
與DNA指紋條帶數(shù)不同，冬季DNA指紋的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)略高于夏季(p>0.05)，冬季和夏季H′值的變化范圍分別為2.51~2.88和2.48~2.79;而均勻度(J)則在冬季明顯較高(p<0.01)，冬季和夏季分別為0.83~0.93以及0.80~0.88.
3.4 浮游細菌DNA指紋與環(huán)境因子的關(guān)系
從浮游細菌與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系可以看出，DNA指紋條帶數(shù)與環(huán)境因子密切相關(guān)，其中與溫度和鹽度明顯正相關(guān)(p<0.05)，而與pH、DO以及透明度明顯負相關(guān)(p<0.05或p<0.01)，結(jié)果說明高溫高鹽可促進浮游細菌多樣性，而pH、DO、透明度下降等水質(zhì)惡化現(xiàn)象則可降低浮游細菌的種類豐富程度.H′值僅與J值呈明顯正相關(guān);而J則與水溫明顯負相關(guān)，與pH和DO明顯正相關(guān).各種環(huán)境因子之間幾乎均呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)關(guān)系，其中水溫與pH、DO、透明度均明顯負相關(guān)(p<0.05或p<0.01)，說明夏季水質(zhì)較冬季差;而DO又與pH和透明度明顯正相關(guān)(p<0.01).
圖5 大亞灣浮游細菌DNA指紋的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)和PieLou均勻度(J)(a. H′，b. J)
表2 浮游細菌DNA指紋及其多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系
4 討論
4.1 大亞灣海域浮游細菌多樣性
浮游細菌種類豐富程度以及DNA指紋條帶數(shù)與海域環(huán)境狀況以及富營養(yǎng)化程度密切相關(guān)，在富營養(yǎng)化海區(qū)細菌豐度較高，但種類數(shù)和多樣性下降.在本研究中，DNA指紋條帶數(shù)與pH、DO以及透明度均呈明顯的負相關(guān)關(guān)系，說明水質(zhì)能影響浮游細菌的種類數(shù).大亞灣海域浮游細菌種類較豐富，每個樣品觀察到的DNA條帶數(shù)為18~25條，冬季和夏季分別檢測到32和33條帶.在同期的可培養(yǎng)浮游細菌調(diào)查中，共分離培養(yǎng)了70株菌株，根據(jù)16S rDNA序列分析，獲得了35個不同序列，細菌種類數(shù)與本研究相近.大亞灣海域浮游細菌的DNA指紋條帶數(shù)明顯高于以往的研究報道，如黃海冷水團海域的浮游細菌DNA指紋條帶數(shù)僅17條左右(劉敏等，2008)，東海長江口赤潮高發(fā)區(qū)各站位浮游細菌指紋條帶數(shù)不超過20條，葡萄牙的Ria de Aveiro海域浮游細菌的條帶數(shù)與本研究相近，為17~24條;而與地中海西北部海域浮游細菌的DNA指紋條帶數(shù)相近，為26~36條.
但是大亞灣海域浮游細菌的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)較低，平均僅為2.63，低于其他海域浮游細菌多樣性指數(shù)，并且低于同期調(diào)查的本海域可培養(yǎng)浮游細菌的多樣性指數(shù).大亞灣海域DNA指紋條帶較豐富，說明該海域物種數(shù)較豐富，但某些耐受能力較強的物種在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢，致使細菌菌落結(jié)構(gòu)多樣性下降.從DNA指紋圖譜和帶型模擬圖中也可看出，優(yōu)勢種類亮度較高，優(yōu)勢度明顯.大亞灣海域曾被認為是我國近岸海域水質(zhì)較好的港灣之一，但近年來富營養(yǎng)化程度明顯上升，而且營養(yǎng)鹽補充及時，初級生產(chǎn)力較高(孫翠慈等，2006).在近年來的浮游植物調(diào)查中，也發(fā)現(xiàn)大亞灣浮游植物種類豐富，數(shù)量較高，浮游植物種類多樣性指數(shù)較低的現(xiàn)象.
雖然夏季浮游細菌的DNA指紋條帶數(shù)明顯高于冬季，但冬季的種類多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)略高于夏季.一般在溫帶海域浮游細菌季節(jié)變化明顯，冬季細菌種類多樣性和數(shù)量均明顯低于夏季.大亞灣位于亞熱帶，全年平均水溫在25 ℃以上，冬季水溫也較高，即使在12月份水溫也達到20 ℃左右.因此，浮游細菌的生長不會受到冬季低溫的影響，但浮游細菌DNA指紋條帶數(shù)仍與水溫呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，而H′則與水溫負相關(guān)，結(jié)果說明高溫能促進細菌種類數(shù)，但種類多樣性下降.大亞灣海域浮游植物群落結(jié)構(gòu)與浮游細菌相近，同樣是夏秋季節(jié)浮游植物種類豐富，數(shù)量較高，但是多樣性指數(shù)較低;冬季雖然種類數(shù)下降，數(shù)量也同時下降，各物種分布更加均勻，種類多樣性上升.而浮游細菌群落結(jié)構(gòu)變化主要由水體中營養(yǎng)物質(zhì)引起以及有機質(zhì)有關(guān)，大亞灣屬于一個封閉性養(yǎng)殖內(nèi)灣，有機物質(zhì)含量豐富，而冬季浮游植物高峰也為浮游細菌提供了豐富的有機質(zhì).
4.2 DGGE技術(shù)在細菌群落結(jié)構(gòu)研究中的應用
DGGE技術(shù)能在一定程度上較全面反映浮游細菌群落結(jié)構(gòu)，不能培養(yǎng)的細菌特別是未能培養(yǎng)的優(yōu)勢菌群能在DGGE圖譜中得到反映.如與本研究同時采集的大亞灣水樣，用培養(yǎng)法一個樣品最多能培養(yǎng)出12個菌株(江曉亮等，2013)，而DGGE技術(shù)則能顯示出18~25個條帶.但是利用PCR-DGGE技術(shù)對細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析尚存在一些不足，在PCR-DGGE過程中，優(yōu)勢種對非優(yōu)勢種具有屏蔽作用，DNA樣品中低于1%的種類無法在DGGE圖譜中顯現(xiàn)出來(Muyzer et al., 1993);而不同細菌之間基因的拷貝數(shù)以及基因組大小的差異性也會對細菌DNA指紋數(shù)及亮度產(chǎn)生影響，從而導致該技術(shù)對浮游細菌群落結(jié)構(gòu)的評價產(chǎn)生偏差.
此外PCR-DGGE技術(shù)不能對細菌進行準確的分類鑒定，僅能相對反映細菌的種類多樣性.如果需要對細菌進行進一步分類鑒定，需要切膠測序.而且PCR-DGGE技術(shù)不能準確對細菌進行定量分析，DGGE條帶的強弱程度只能表示不同種類的細菌之間的相對豐度.雖然本研究未對DGGE條帶進行切膠測序，但在同期調(diào)查中對可培養(yǎng)細菌進行了16s rDNA 序列測定(江曉亮等，2013)，分析鑒定了35種可培養(yǎng)細菌，其中以α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和放線菌綱(Actinobacteria)為分離最多的兩大類，此外還包括β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、蓋球菌屬(Kytococcus)以及間胞囊菌屬(Intrasporangium)的菌株.
由此可見，雖然PCR-DGGE技術(shù)在研究群落動態(tài)和多樣性方面存在優(yōu)勢，但該技術(shù)無法給出細菌的代謝活性、數(shù)量和基因表達水平方面的信息，必須與其他技術(shù)相結(jié)合以彌補其本身的不足，如酶學分析均可以提供群落代謝活性特征，熒光原位雜交技術(shù)可以提供細菌的相對數(shù)量，而通過與熒光定量PCR結(jié)合，可以對群落的細菌數(shù)量進行定量分析.因此，PCR-DGGE技術(shù)與其他分類以及分子生物學技術(shù)結(jié)合后，可更好地反映海洋細菌群落結(jié)構(gòu)與功能.
4 結(jié)論
1)大亞灣海域浮游細菌DNA指紋條帶豐富，在2010年冬和2011年夏的調(diào)查中共分別得到32和33條DNA指紋條帶，每個樣品的DNA條帶數(shù)為18~25條.
2)高溫高鹽可促進浮游細菌多樣性，而pH、DO、透明度下降則可降低浮游細菌的種類豐富程度.
3)夏季DNA指紋條帶數(shù)明顯高于冬季，但冬季的多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)較高.
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