強(qiáng)化生物除磷技術(shù)(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR)由于經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各大城市污水處理廠.通過分子生物技術(shù)已經(jīng)確認(rèn)菌群β-Proteobacteria是EBPR活性污泥中的優(yōu)勢聚磷菌(PAOs)，將其命名為C and idatus Accumulibacter(Hesselmann et al., 1999;Crocetti et al., 2000).Accumulibacter 是目前污水生物處理領(lǐng)域廣泛認(rèn)可并且研究最多的一種PAOs(Zilles et al., 2002).ppk1基因可以編碼合成poly-P的聚合磷酸鹽激酶(PPK1)，其進(jìn)化速度是16S rRNA 的5倍，是研究Accumulibacter各進(jìn)化分支很好的基因標(biāo)記物.McMahon等(2007)基于ppk1的系統(tǒng)發(fā)育分析將Type I劃分為Type I和Type II，其中，Type I 進(jìn)一步劃分為IA、IB、IC、ID、IE 5個(gè)分支;Type II劃分為IIA、IIB、IIC、IID、IIE、IIF、IIG 7個(gè)分支.
現(xiàn)有研究證實(shí)，Accumulibacter在污水廠存在很高的多樣性，且主要分布于TypeⅡ，但水廠運(yùn)行與各分支分布的相關(guān)性不清楚.宏基因組的研究也證實(shí)了分支多樣性，這種多樣性與污水處理廠的穩(wěn)定性有一定關(guān)系(Albertsen et al., 2012).Mielczarek等(2013)對(duì)丹麥28個(gè)污水處理廠的研究發(fā)現(xiàn)，IA和IIC分支幾乎出現(xiàn)在每個(gè)處理廠.Peterson等(2008)對(duì)美國幾個(gè)污水處理廠及一些淡水湖泊、河口沉積物樣品進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，IID存在于大部分的淡水、河口沉積物中及少部分污水處理廠中，有的湖泊淡水中僅發(fā)現(xiàn)IID 1個(gè)分支.由此可見，來自不同地域的污水處理廠，Accumulibacter進(jìn)化枝的分布有明顯差異.對(duì)實(shí)際污水處理系統(tǒng)中Accumulibacter的研究主要發(fā)現(xiàn)了IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF這6個(gè)分支，尤其是前5個(gè)分支的研究報(bào)道較多(He et al., 2007; Gebremariam et al., 2011; McMahon et al., 2007; Mielczarek et al., 2013)，IIF較少存在.而在本研究中IIF在幾個(gè)污水處理系統(tǒng)中含量豐富，首次作為重點(diǎn)研究.其他6個(gè)分支(IB、IC、ID、IE、IIE、IIG)主要存在于自然界的淡水、湖泊、河流沉積物等地方，很少在實(shí)際污水處理廠中出現(xiàn)(McMahon et al., 2007).因此，著重關(guān)注IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF這6個(gè)分支而不是整體的12個(gè)分支.關(guān)于中國城市污水處理廠中Accumulibacter 6個(gè)分支的菌群結(jié)構(gòu)及定量分析的研究尚未見報(bào)道.
近年來，許多研究者針對(duì)污水處理系統(tǒng)的運(yùn)行參數(shù)和Accumulibacter各分支的組成分布的關(guān)系展開研究.關(guān)于電子受體的影響，Kim等(2013)認(rèn)為所有桿狀的Accumulibacter分支，包括分支IIC、 IA和IIF在具有足夠的硝酸鹽還原活性的污泥中可以成功的利用硝酸鹽吸磷.Flowers等(2009)發(fā)現(xiàn)反硝化吸磷時(shí)，IA、IIA分別以硝酸鹽、亞硝酸鹽作電子受體.Flowers等(2013)在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)力學(xué)上Clade IIA活性與溫度正相關(guān)，而IA與溫度呈負(fù)相關(guān).迄今為止，究竟有哪些因素主導(dǎo)了實(shí)際污水處理系統(tǒng)Accumulibacter的種群結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化仍然沒有確切的研究結(jié)果.
本研究選擇9個(gè)具有代表性的大型市政污水處理廠，分析不同運(yùn)行狀況的污水處理廠活性污泥中C and idatus Accumulibacter主要分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的豐度及分布特點(diǎn)，揭示污水處理廠C and idatus Accumulibacter進(jìn)化枝水平菌群結(jié)構(gòu)、豐度與工藝運(yùn)行的相關(guān)性.
2 材料與方法
2.1 城市污水處理廠的活性污泥樣品
實(shí)驗(yàn)所用的污泥樣品分別采集于9個(gè)污水處理廠，其中有2個(gè)水廠各包含2個(gè)工藝，共11個(gè)工藝.每個(gè)工藝取1個(gè)污泥樣品.其中，針對(duì)A2O+纖毛狀生物膜(CNR)工藝取2個(gè)樣品，分別位于加膜區(qū)和無膜區(qū)，是為了考察加膜對(duì)聚磷菌的菌群結(jié)構(gòu)是否有影響，因此，共有12個(gè)樣品.12個(gè)樣品依次命名為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L.其中，B和C取自同一水廠，I和J取自同一水廠，E和F取自A2O+纖毛狀生物膜工藝的加膜區(qū)和無膜區(qū).污水處理廠的運(yùn)行參數(shù)及進(jìn)出水指標(biāo)見表 1.
表1 活性污泥樣品對(duì)應(yīng)的污水處理系統(tǒng)的運(yùn)行參數(shù)及進(jìn)出水指
2.2 DNA提取、PCR、克隆測序
用1×PBS(0.01 mol · L-1，pH=7.2~7.4)清洗污泥樣品3次，14000×g離心2 min，去除上清液，置于-20 ℃保存.采用試劑盒(Fast DNA Spin kit for soil，MP，USA)對(duì)DNA進(jìn)行提取.提取后的DNA 通過Nanodrop Spectrophotometer ND-1000(Thermo Fisher Scientic，USA)測量核酸濃度及純度.
特異性正向引物ppk1-254F(TCACCACCGACGGCAAGAC)和反向引物ppk1-1376R(ACGATCATCAGCATCTTGGC)用來擴(kuò)增總C and idatus Accumulibacter ppk1 基因，片段長度為1123 bp.PCR反應(yīng)采用試劑盒(Promega GoTaq Green Master Mix，USA)，反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL GoTaq Green Master Mix，1 μL(10 mmol · L-1)正向引物，1 μL(10 mmol · L-1)反向引物，0.5~2 μL DNA模板，剩余體系用純水補(bǔ)齊.PCR程序包括：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性45 s，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃反應(yīng)5 min.
獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(Agarose MS-6，TaKaRa，Japan)檢測，為單一的目的條帶，切膠，用Takara Agarose Gel DNA Purication Kit Ver. 2.0(Takara，Dalian，China)純化.得到的DNA用試劑盒(Zero Background TA Topoisomerase Cloning Kit，Clonesmarter，USA)進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化.連接體系為10 μL，包括1 μL pCloneEZ-TOPO載體，1 μL 10×Enhancer，0.5~8.0 μL DNA，一定量的純水補(bǔ)齊體系.連接反應(yīng)完成后將產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞DH5a(中美泰和，國產(chǎn))中進(jìn)行轉(zhuǎn)化.每個(gè)樣品隨機(jī)挑出一定量的陽性克隆子進(jìn)行測序，構(gòu)建克隆文庫.
2.3 克隆文庫建立和系統(tǒng)發(fā)育分析
構(gòu)建文庫的序列通過Mothur 軟件按照 97%相似度進(jìn)行 OTU 劃分，將每個(gè) OTU 的代表序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載的相似性最高最具代表性的菌株序列一起進(jìn)行比對(duì).采用 MEGA5.0 利用鄰接法(Neighbor Joining Method)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過自舉分析方法(Bootstrap)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信度，重復(fù)1000次.
2.4 實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)
采用特異性引物對(duì)C and idatus Accumulibacter主要的6個(gè)分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的ppk1片段和全菌的16S rRNA進(jìn)行QPCR擴(kuò)增(He et al., 2007; Ong et al., 2014).反應(yīng)在Mx3005P實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(Agilent Technologies，American)上進(jìn)行，采用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq kit進(jìn)行反應(yīng)，體系為25 μL包括12.5 μL的SYBR緩沖液，正反向引物各1 μL(10 mmol · L-1)，0.5 μL ROX，DNA模板2 μL，剩余體系用純水補(bǔ)齊.特異性引物序列及擴(kuò)增程序見表 2.
表2 QPCR各分支的特異性引物序列及擴(kuò)增程序
本研究采用質(zhì)粒法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.C and idatus Accumulibacter 6個(gè)分支IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線中的初始模板濃度與Ct值之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，R2在0.990~1.000之間，擴(kuò)增效率在92%~109.7%之間.
2.5 登錄號(hào)
測得的序列上傳至 GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得的聚磷菌的序列登錄號(hào)為：KP147989~KP148181、KT024045~ KT024419.
3 結(jié)果與討論
3.1 12個(gè)活性污泥樣品中C and idatus Accumulibacter 的定量分析
采用實(shí)時(shí)定量PCR定量分析Accumulibacter(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)6個(gè)分支的豐度，結(jié)果如圖 1所示.Accumulibacter 6個(gè)分支均為單拷貝基因，即Accumulibacter的細(xì)胞數(shù)為ppk1基因的拷貝數(shù).總Accumulibacter的定量變化范圍為7.32×107(D)~3.05×109 cells · g-1(L)，平均為1.20×109 cells · g-1(以MLSS計(jì)).在12個(gè)樣品中，只有D樣品數(shù)量級(jí)為107，比其他樣品低1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，其中的Accumulibacter ppk1基因含量偏低;有6個(gè)樣品數(shù)量級(jí)為108，分別為H、B、C、I、J和K;樣品A、E、G、F和L的數(shù)量級(jí)為109，這5個(gè)樣品中的Accumulibacter的ppk1基因含量高于其他樣品，其中樣品L(A2O工藝)含量最高，達(dá)到了3.05×109 cells · g-1(以MLSS計(jì)).12個(gè)樣品中Accumulibacter占總菌的百分比變化范圍為0.58%~ 22.77%，平均為9.17%(圖 1).
圖1 Accumulibacter豐度及占總菌的比例
Mielczarek等(2013)通過FISH技術(shù)對(duì)丹麥28個(gè)城市污水處理廠中Accumulibacter進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，Accumulibacter占總菌的平均比例為3.7%，低于本研究結(jié)果.而He等(2008)對(duì)5個(gè)污水處理廠中Accumulibacter占總菌比例的研究結(jié)果為9%~24%，與本研究結(jié)果基本一致.
從圖 1中可以看出，樣品A、E、F、G和L中Accumulibacter的豐度均在109 cells · g-1(以MLSS計(jì))以上，而這5個(gè)樣品中，L為A2O工藝、A為A2O+MBR工藝、E、F為A2O+NAR工藝，樣品G為倒置A2O工藝，且在5個(gè)樣品中豐度偏低.由此可見，A2O工藝及其改良工藝中Accumulibacter的豐度最高.且來自同一工藝的樣品E和F證實(shí)了在A2O工藝的基礎(chǔ)上加膜不會(huì)對(duì)Accumulibacter的豐度造成影響.同為氧化溝工藝的樣品H和樣品K中Accumulibacter的豐度在同一數(shù)量級(jí)上，為108 cells · g-1(以MLSS計(jì)).AO工藝的樣品J中Accumulibacter的豐度和樣品H(氧化溝)在同一數(shù)量級(jí)，和樣品G同為倒置A2O工藝的樣品I要比樣品G小一個(gè)數(shù)量級(jí).由此判斷，倒置A2O工藝和氧化溝工藝的Accumulibacter豐度也處于比較高的水平，只有CASS工藝對(duì)應(yīng)的樣品中Accumulibacter豐度明顯低于其他工藝.各個(gè)樣品中Accumulibacter占總菌的比例與各個(gè)樣品Accumulibacter的豐度變化趨勢基本保持一致.
Accumulibacter 6個(gè)分支定量結(jié)果見圖 2.6個(gè)分支在12個(gè)污泥樣品中豐度變化范圍及各分支占總Accumulibacter的變化范圍見表 3.從圖 2可以看出，Accumulibacter的6個(gè)分支中，IIC和IID處于同一數(shù)量級(jí)，為108 cells · g-1(以MLSS計(jì))，分別占Accumulibacter總菌的比例為75.34%和14.87%，是污水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌屬.尤其是IIC豐度達(dá)到了109 cells · g-1(以MLSS計(jì)). IIA、IIB和IIF處于同一數(shù)量級(jí)，為107cells · g-1(以MLSS計(jì))，比IIC和IID低一個(gè)數(shù)量級(jí)，這3個(gè)分支之和占Accumulibacter 總菌的比例為9.34%.IA含量最少，數(shù)量級(jí)比IIC和IID低2個(gè)數(shù)量級(jí)，占Accumulibacter總菌的比例僅為0.32%.Accumulibacter的 6個(gè)分支均存在于每個(gè)工藝中，但Type I所占比例不到1%，而Type II接近100%.各個(gè)分支的變化基本和總Accumulibacter變化趨勢一致，與Mielczarek等(2013)的研究結(jié)論一致，不同的是Mielczarek等沒有發(fā)現(xiàn)任何處理廠含有Accumulibacter的5個(gè)分支(IA~IID). 本研究首次報(bào)道了IIC在9個(gè)城市污 水處理廠中豐度最高，IA在9個(gè)水廠中豐度最低，Accumulibacter的這種群落分布特點(diǎn)明顯不同于其他污水處理廠.Type II中的6個(gè)分支在12個(gè)污泥樣品中呈現(xiàn)不同的分布特點(diǎn)，定量結(jié)果證實(shí)了城市污水處理廠Accumulibacter進(jìn)化枝水平分布的多樣性.
圖2 Accumulibacter各進(jìn)化分支豐度及相對(duì)含量
表3 12個(gè)樣品中C and idatus Accumulibacter中各進(jìn)化分支的比例
3.2 12個(gè)活性污泥樣品中C and idatus Accumulibacter 基于OTU的多樣性分析
9個(gè)污水處理廠，共12個(gè)樣品，構(gòu)建12個(gè)ppk1基因克隆文庫進(jìn)行分析.12個(gè)克隆文庫的Good 覆蓋率、Chao1 豐富度估計(jì)、OTU 值與估計(jì)的 Chao1 值之比(OTUobserved/OTUestimated)、香農(nóng)指數(shù)見表 4.12個(gè)污泥樣品的ppk1基因的OTUs分布如圖 3所示.如表 4所示，12個(gè)樣品的Good覆蓋率變化范圍為71.43%~98.15%.計(jì)算的 OTU 值與估計(jì)的 Chao1 值之比除了樣品A為47.06%，其余11個(gè)樣品在62%~100%之間.Mehlig等(2013)對(duì)國外8個(gè)污水處理廠進(jìn)行了研究，Good覆蓋率只有35.4%~65.4%.說明本研究的12個(gè)克隆文庫可以代表 12個(gè)樣品中Accumulibacter的群落組成.樣品A可能需要測更多的數(shù)據(jù)保證數(shù)據(jù)的可信度.
表 4同時(shí)給出了12個(gè) ppk1 基因克隆文庫中的香農(nóng)指數(shù)，根據(jù)表中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品C只有1個(gè)OTU，說明該樣品中ppk1基因多樣性很低，香農(nóng)指數(shù)為零.另外11個(gè)樣品的香農(nóng)指數(shù)在0.15~2.04之間，其中，樣品A、D、G、J和K含有較豐富的多樣性.He等(2007)對(duì)9個(gè)市政污水處理廠中Accumulibacter的群落進(jìn)行研究，香農(nóng)指數(shù)在0.2~1.4之間.與本研究對(duì)12個(gè)克隆文庫中Accumulibacter的群落多樣性研究相符合.
表4 克隆文庫中序列多樣性及覆蓋率
12 個(gè)ppk1基因克隆文庫中共得到568 條 ppk1序列，按照 3% cut-off的距離劃分為 29個(gè) OTUs. 從圖 3可以看出，樣品C僅有1個(gè)OTU，意味著樣品C中Accumulibacter的多樣性最不豐富.而樣品B和樣品I分別包含3、2個(gè)OTUs，說明這2個(gè)樣品中Accumulibacter的多樣性水平比較低.樣品A、D、G、J、H和K分別含有8、6、10、8、7和10個(gè)OTUs，具有較高的多樣性水平，樣品E、F和L均含有5個(gè)OTUs，較前6個(gè)樣品多樣性偏低.
OTU1共出現(xiàn)12次，即每個(gè)樣品中都有序列出現(xiàn)在OTU1中，同時(shí)還是樣品B、C、E、F、F、I和J共6個(gè)克隆文庫中的優(yōu)勢OTUs.OTU3和OTU5在6個(gè)樣品中出現(xiàn)，尤其在樣品H的克隆文庫中分布廣泛.OTU7出現(xiàn)了4次.有4個(gè)OTUs共出現(xiàn)3次，分別為OTU2、OTU4、OTU6和OTU11.上述8個(gè)OTUs為Accumulibacter的主要種屬.有10個(gè)OTUs(OTU10、OTU12、OTU13、OTU15、OTU17~ OTU20、OTU22、OTU23)出現(xiàn)2次，有11個(gè)(OTU9、OTU10、OTU14、OTU16、OTU21、OTU24~ OTU29)共出現(xiàn)1次，這21個(gè)OTUs中每個(gè)OTUs包含1~2條ppk1序列，不是Accumulibacter的主要種屬.
圖3 12個(gè)污泥樣品的ppk基因的OTU分布圖
3.3 12個(gè)活性污泥樣品中C and idatus Accumulibacter基于系統(tǒng)發(fā)育樹的多樣性分析
利用29個(gè)OTUs的代表序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 4所示.He等(2007)對(duì)9個(gè)市政污水處理廠中Accumulibacter的群落進(jìn)行分析認(rèn)為，實(shí)際污水處理廠污水組成和運(yùn)行情況比較復(fù)雜會(huì)導(dǎo)致污水中Accumulibacter種類比較豐富，所測得的序列至少分布在3個(gè)進(jìn)化枝中.Type I包括IA、IB、IC進(jìn)化枝，Type II包括IIA、IIB、IIC、IID、IIF進(jìn)化枝.ID、IE、IIE和IIG在淡水和河口沉積物中發(fā)現(xiàn)，在此不做考慮.另外，序列Rhodocyclus tenuis 作為參考序列.以往的研究均是通過各個(gè)水廠中的代表序列建系統(tǒng)發(fā)育樹，但本研究中采用各OTUs中代表序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，這樣更方便從整體上觀察幾個(gè)工藝中Accumulibacter的分布情況.如圖 4所示，OTUs在幾個(gè)進(jìn)化枝間分布比較均勻，有27個(gè)OTUs屬于Type II型的Accumulibacter，僅有2個(gè)OTUs(共12條序列)屬于Type I型，說明實(shí)際污水除磷系統(tǒng)中的Accumulibacter主要以Type II型為主，與QPCR結(jié)果一致.
圖4 基于ppk1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹
結(jié)合圖 4和圖 5可知，IIA包含6個(gè)OTUs(88條序列)，IIB包含3個(gè)OTUs(6條序列)，IIC包含11個(gè)OTUs(124條序列)，IID包含4個(gè)OTUs(315條序列)，IIF包含1個(gè)OTU(共23條序列).其中，優(yōu)勢OTUs(OTU1~OTU3)分別隸屬于IID、IIC、IIA.QPCR和PCR-Cloning-Sequencing的研究結(jié)果都證實(shí)了12種污水處理工藝中Type I豐度很低，主要以 Type II為主，且IIA、IIC、IID是系統(tǒng)中的優(yōu)勢分支.
圖5 12個(gè)污泥樣品中Accumulibacter 6個(gè)分支分布圖
3.4 C and idatus Accumulibacter各進(jìn)化枝的分布與EBPR性能之間的關(guān)系
結(jié)合12個(gè)污泥樣品的QPCR分析和克隆文庫的分析可知，Type I和Type II均存在于城市污水處理廠中，以Type II為主，Type I占Accumulibacter總量的比例低于0.32%.Type II中以IIC為主，IID、IIA次之，IIB含量較不豐富，而IA豐度最小.這與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中Accumulibacter的種群結(jié)構(gòu)明顯不同，實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器富集的Accumulibacter主要以IA和IIA為主(He et al., 2010;Gonzalez-Gil et al., 2011).對(duì)于污水處理廠中Accumulibacter各進(jìn)化枝的分布與EBPR性能之間的關(guān)系分析如下：
1)除磷效果不好可能和IID占總Accumulibacter比例較高有關(guān).本課題組前期對(duì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的MUCT反應(yīng)器中Accumulibacter種群進(jìn)行反硝化除磷的研究，發(fā)現(xiàn)在以NO-2為電子受體的反硝化除磷系統(tǒng)中IID始終是優(yōu)勢菌屬，占總Accumulibacter的90%以上(曾薇等，2013)，說明IID分支適合于以NO-2為電子受體進(jìn)行缺氧吸磷.而實(shí)際污水處理廠是以O(shè)2為電子受體的好氧吸磷及以NO-3為電子受體的缺氧吸磷，IID比例的升高導(dǎo)致除磷效果變差.
2)關(guān)于IIC在污水處理廠中的功能還需要進(jìn)一步的研究.有報(bào)道稱IIC可以利用硝酸鹽為電子受體進(jìn)行缺氧吸磷(Kim et al., 2013)，但也有報(bào)道稱IIC是導(dǎo)致EBPR系統(tǒng)惡化的原因(Slater et al., 2010).由此可見，在系統(tǒng)發(fā)育上屬于同一進(jìn)化枝的Accumulibacter由于工藝和運(yùn)行條件的不同可能會(huì)具有不同的功能.
4 結(jié)論
1)QPCR結(jié)果表明，Accumulibacter 6個(gè)進(jìn)化枝(IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)存在于12個(gè)污泥樣品中，占污水處理系統(tǒng)中總菌的比例平均為9.17%.A2O工藝及其改良工藝中總Accumulibacter豐度最高，占到總菌的22.8%，具有較好的生物除磷性能.分支IIC在11種工藝中均豐度最高，平均占總Accumulibacter比例的75.34%.IID次之，占總Accumulibacter的比例平均為14.87%，IA豐度最低，占總Accumulibacter比例平均只有0.32%.
2)12個(gè)活性污泥樣品的系統(tǒng)發(fā)育分析也證實(shí)了Accumulibacter以Type II 為主，Type I少量存在.TypeII中以IIC、IID、IIA為主，IIB、IIF豐度偏低.
3)污水處理廠中Accumulibacter各進(jìn)化枝的分布與EBPR性能之間存在一定關(guān)系.除磷效果不好可能和以亞硝酸鹽為電子受體的IID占總Accumulibacter比例較高有關(guān).而IIC在污水處理廠中的功能還需要進(jìn)一步的研究.
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